鼠伤寒沙门菌ΔsodA缺失株的构建及生物学特性研究
刘宝宝1，张建康1，易力2，王慧芳1，王瑜欣1，宫胜龙1，涂春田1，汪洋*
(1.河南科技大学动物科技学院畜禽分子病原与免疫学重点实验室洛阳；2.洛阳师范学院生命科学学院洛阳）
摘要：鼠伤寒沙门菌作为病原菌，在入侵宿主体内之后会遭遇到宿主出于免疫保护而形成的高活性氧（ROS）内环境。过量的ROS会对生物体的DNA、蛋白质和脂类等产生毒害作用。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)作为唯一可以清除超氧阴离子（?O2-）的抗氧化酶系成员，是细胞抵御ROS胁迫的第一道防线。已有研究表明，SOD参与到细菌的生长、菌膜生成、毒力等方面，但是对于其在鼠伤寒沙门菌中的功能研究，迄今为止还未见报道。因此本实验利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌sodA基因缺失株LSM52ΔsodA以及互补株LSM52CΔsodA，并对其生长速度、运动性、抗氧化胁迫能力、菌膜形成能力、耐环境压力（酸、碱、渗透压、血清）、ROS测定、酶活性等生物学特性进行研究。结果显示，LSM52ΔsodA以及LSM52CΔsodA构建成功。显示LSM52ΔsodA的生长速度明显低于野生株LSM52，互补株LSM52CΔsodA与野生株LSM52无明显差别，互补株LSM52CΔsodA可以恢复生长速度；sodA对运动性没有影响；LSM52ΔsodA组形成的菌膜量远远小于野生株LSM52（P0.05）；互补株LSM52CΔsodA形成菌膜的能力与LSM52无差异，并且恢复了LSM52ΔsodA生成菌膜的能力；抗氧胁迫胁迫能力测定结果显示LSM52与LSM52CΔsodA组的抑菌环大小无明显差。LSM52ΔsodA组与LSM52和LSM52CΔsodA组差异明显（P0.05）；使用NBT法对ROS检测后，结果显示LSM52ΔsodA与LSM52、LSM52CΔsodA的iROS与eROS有明显差异，结果表明LSM52ΔsodA组的iROS与eROS高于LSM52、LSM52CΔsodA（P0.01）；通过邻苯三酚自养化法检测三组菌株SOD活性，结果显示LSM52的SOD活性显著LSM52ΔsodA高于（P0.01），LSM52CΔsodA的SOD活性也明显高于LSM52（P0.05）这可能是由于LSM52CΔsodA所含质粒的高拷贝性质导致互补株体内的SOD被大量表达，使得其SOD活性明显升高；通过对LSM52、LSM52ΔsodA和LSM52CΔsodA的耐环境压力进行检测，结果显示发现三株菌在碱性、酸性、高渗透压条件下没有明显差异；在耐血清试验中，结果表明LSM52ΔsodA的生存率明显小于LSM52、LSM52CΔsodA（P0.01）这可能是由于SOD也参与到了细菌的毒力中。LSM52生存率与LSM52CΔsodA相比无明显差异。鼠伤寒沙门菌sodA基因的突变，造成野生株LSM52在生长速度、抗氧胁迫、菌膜生成能力、SOD活性以及抗血清等生物学特性方面的下降；同时胞内的ROS含量显著升高；而运动性、耐酸、耐碱耐渗透压能力不受影响。回补sodA之后，则可以较好的恢复到野生株原本水平。这为更进一步研究鼠伤寒沙门菌sodA的作用以及功能奠定了良好的基础。
关键词：鼠伤寒沙门菌；sodA基因；缺失；生物学特性
鼠伤寒沙门菌sodA基因对巨噬细胞自噬的影响东笑1，李金朋1，樊擎莹1，钱满1，刘宝宝1，张建康1，易力2*，汪洋*
(1.河南科技大学动物科技学院畜禽分子病原与免疫学重点实验室洛阳；2.洛阳师范学院生命科学学院洛阳）
摘要：自噬是细胞的一种自我保护机制。自噬是维持生物体新陈代谢、与内环境稳态的重要过程，通过消除和降解受损、变性、衰老的细胞、细胞器以及变性的蛋白质与核酸等，使自身保持动态平衡。在个体发育疾病以及肿瘤等方面研究中，自噬机制研究越来越深入。自噬在抗病原微生物感染免疫中也发挥着非常重要的作用。病原菌侵入宿主胞内后，细胞迅速启动自噬过程，通过自噬体包裹病原菌，并与溶酶体融合杀灭病原菌。宿主通过吞噬作用来清除入侵到胞内的细菌，减轻感染，提高自身存活率。细胞自噬发生的标志物是LC3-Ⅱ，它是自噬体膜表面标记物。自噬发生过程中，胞浆内的LC3-I在其类泛素化酶催化作用下，C端和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethano-lamine，PE)偶联后转变为LC3-II，结合在自噬体膜[。自噬发生状态越高，LC3-II点状结构聚集越多。Beclin-l是自噬启动的标志，是自噬过程中一种重要的蛋白质，也是自噬发生过程中重要的正调节因子。p62蛋白是自噬降解途径的重要蛋白。自噬发生后，与泛素化的蛋白结合，再与自噬体膜上的LC3结合，被不断吞噬、消耗，属于负调控因子。将LSM52、LSM52ΔsodA、LSM52CΔsodA感染鼠巨噬细胞RAW.7后，应用荧光共聚焦观察LC3-Ⅱ变化；以及蛋白免疫印迹(Westernblot，WB)法检测不同时间点自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62含量的变化；观察不同时间点胞内活菌数量变化。荧光共聚焦结果显示，在细胞与细菌共培养1h后，LSM52ΔsodA感染组胞内LC3-Ⅱ的点状聚集数量明显高于LSM52、LSM52CΔsodA组（p0.05），共培养2h和3h之后，点状聚集物无明显变化；WB结果显示，在细胞与细菌共培养1h后，LSM52ΔsodA感染组的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达量都比LSM52、LSM52CΔsodA组明显上升（p0.05），p62蛋白表达量下调明显，共培养2h和3h之后没有明显变化。活菌计数CFU结果显示，在共培养1h之后，三组活菌数量无明显差异，随着时间延长到2h和3h后，LSM52、LSM52CΔsodA感染组胞内活菌数明显高于LSM52ΔsodA感染组（p0.05）。以上结果显示sodA对发生在细菌细胞共作用早期的自噬有抑制作用，利于携带sodA基因的宿主菌在细胞内的存活。但是细菌入侵细胞之后的感染的发生和发展过程极为复杂，受多种因素的影响和调节。SodA是通过何种途径抑制宿主细胞的自噬，如何与基因协同发挥作用以及机体是如何应对感染的发生，这些问题还有待于进一步深入研究。
关键词：鼠伤寒沙门菌；sodA基因；巨噬细胞；自噬
信号分子调控细菌生物被膜形成的研究进展涂春田1，刘宝宝1，宫胜龙1，王瑜欣1，易力2*，汪洋*
(1.河南科技大学动物科技学院畜禽分子病原与免疫学重点实验室洛阳；2.洛阳师范学院生命科学学院洛阳）
摘要：细菌生物被膜（Bacterialbiofilm，BF）是指黏附于机体黏膜或生物材料表面、由细菌分泌的外聚合细胞物质（extracellularpolymericsubstances，EPS）组成的被膜状生物群体，是造成慢性感染的重要原因之一。据报道，自然界中成熟的细菌均可形成BF，成熟的BF可以是同种或不同种细菌共同形成。细菌BF状态被认为是一种细菌适应不良环境而形成的保护模式。已经证明，与浮游细胞相比，生活在BF内的细菌抵抗抗生素和免疫系统的能力更强，这加强了人们对这种细菌生命形式的初期白癜风怎么治疗哪家看白癜风的医院较好
